Это одно из старейших зданий Санкт-Петербурга. В его облике наиболее проявились традиции древнерусского зодчества. Собор расположен недалеко от места, где Петр I заложил деревянную церковь в память победы под Полтавой 27 июня 1709 года (в день именин св. Сампсония Странноприимца). Церковь и колокольня, возведенные из дерева, постепенно ветшали, а приход расширялся, и поэтому уже во второй половине 1720-х гг. появилась необходимость в новом, более просторном здании.

Существующее здание собора построено неизвестным мастером (предположительно Дж. Трезини и И. Лапшиным, при участии М. Земцова). Строительство церкви, начавшееся в 1728 г., велось в два этапа. Первый был завершен в 1733 г., возведением западной части здания и освящением боковых приделов: - во имя Архистратига Михаила и во имя святого Апостола Иоанна Богослова. Второй этап, начало которого совпало с возвращением Двора Анны Иоанновны из Москвы в Петербург, окончился сооружением восточной части церкви и освящением 19 августа 1740 г. главного престола. Параллельно со строительством храма сооружалась каменная колокольня. Сооружение храма велось попечением причта, купца Н.А. Лапшина и на суммы, пожертвованные частными лицами.

Сампсониевский собор – типичный для своего времени по архитектурным параметрам однонефный храм. Здание собора, выдержанное в стиле раннего барокко, растянуто по оси "восток - запад". В отделке его фасадов использованы профилированные карнизы, рустовка, пилястры. Окна декорированы наличниками. Первоначально собор имел один купол, покоившийся на высоком граненом барабане и увенчанный луковичной главкой. В 1761 году к нему пристроили четыре малых трубчатых барабана с главками в стиле "елизаветинского барокко", в результате чего здание получило традиционное пятикупольное завершение.

В традиционном для русского церковного зодчества стиле были возведены примыкающая к помещению собора с западной стороны трапезная с малыми приделами и многоярусная колокольня, накрытая каменным шатром с крошечными окнами и луковичной главкой. Вдоль боковых фасадов здания протянулись открытые галереи, что почти несвойственно церквам Петербурга.

В соборе сохранился четырехярусный резной деревянный исключительной красоты иконостас главного придела, высотой 11 метров, созданный русскими мастерами в 1737 - 1739 годах, украшенный прямыми и витыми колоннами. В композиции иконостаса широко использованы скульптура и орнаментальная резьба, характерные для стиля аннинского барокко и выполненные с большим мастерством и виртуозностью: головки и фигурки херувимов, гирлянды цветов, картуши разнообразных форм. Иконостас выполнен из сосны, а его скульптурный декор вырезан из липы. По стилистическому решению и размаху замысла он близок творениям Ф.Б. Растрелли.

Внутренняя часть иконостаса окрашена в изумрудно-зеленый цвет. Образа в иконостасе написаны художниками А. Башниным, А. Поспеловым, Т. Баженовым и другими; некоторые из икон, размещенных в иконостасе, были написаны для Царских врат предшествующей церкви. Обилие сложных деталей, светская трактовка скульптурных изображений, чередование света и тени в позолоте создают ощущение движения, барочной динамики. Факт сохранности иконостаса столь раннего происхождения можно считать чудом, поскольку даже во многих более поздних храмах, доживших до наших дней, неоднократно менялись алтарные преграды.

Скромнее оформлены два малых иконостаса приделов Иоанна Богослова и Архангела Михаила - они трехъярусные и расчленены по горизонтали антаблементами, а по вертикали - пилястрами на пять частей. Первоначально иконостасы были окрашены в бирюзовые тона, позже - забелены. В 1909 году при проведении реставрации им вернули первоначальную окраску.

Прекрасными образцами русской школы резьбы являются также великолепная надпрестольная сень и главный престол собора. Большинство икон выполнено в 1720 – 1760 годах. В середине храма находилась икона Божией Матери старинного письма, а с правой стороны – образ Сампсония Странноприимца. В 1894 г. крестных ход тожественно перенес в собор из Пантелеймоновской церкви часть мощей преподобного Сампсония.

Еще в петровскую эпоху при Сампсониевской церкви открылось первое городское кладбище, где хоронили не только православных, но и лютеран. В частности здесь были похоронены многие государственные деятели петровского времени, знаменитые зодчие А. Шлютер, Д. Трезини и Ж.-Б. Леблон, художники Л. Каравакк и С. Торелли. В ограде храма находятся могилы русских патриотов, казненных в период "бироновщины" Артемия Волынского, Петра Еропкина и Андрея Хрущова. В 1885 году над ними был установлен памятник, сооруженный по проекту архитектора М.А. Щурупова. В центре памятника - бронзовый барельеф работы скульптора А.М. Опекушина, изображающий Гения Истории. На барельефе выгравированы стихи Кондратия Рылеева из думы "Волынский":
"И пусть падёт, но будет жив
В сердцах и памяти народной
И он, и пламенный порыв.
Сыны Отечества! В слезах
Ко храму древнего Сампсона.
Там за оградой, при вратах
Почиет прах врага Бирона."

В 1908 г. к двухсотлетию Полтавской битвы, началась полная реставрация храма, которая была оценена современниками как результат "колоссального непрерывного труда". Помимо реставрации фасадов и интерьеров храма по проекту архитекторов А. П. Аплаксина и Н. Е. Лансере построили изящную часовню, сторожку и двухэтажный "Юбилейный дом" с библиотекой и квартирами служащих. В этих зданиях - черты петровского барокко и старого русского зодчества.

На фасаде колокольни была установлена чугунная доска с текстом полтавской речи Петра I. Перед храмом на Б. Сампсониевском проспекте был открыт памятник Петру I, отлитый по модели М. М. Антокольского. В 1940 г. он был демонтирован и ныне находится в Третьяковской галерее. К 300-летию Петербурга, в мае 2003 г. на историческом месте была установлена точная копия этого монумента.

С 1874 г. при церкви действовало благотворительное общество, содержавшее богадельню и приют. Богослужения в храме проводились до 1938 года. В 1942 году собор получил сильные повреждения – попаданием снаряда были разрушены главный купол и один из малых куполов. В 1953 – 1957 годах собор был восстановлен. В его помещениях был открыт музей Полтавской битвы. В 1990-е годы при участии польских специалистов в соборе был проведен комплекс реставрационных работ и его внешний вид полностью восстановлен. Но верующим храм еще не передан. Сейчас собор является филиалом государственного музея "Исаакиевский собор", по определенным датам в нем проводятся богослужения.