Церковь – старейшее сооружение Царскосельского дворцово-паркового ансамбля, первое каменное здание Царского Села.

Находясь в юности более десятилетия в опале, под постоянным страхом ареста или тайной расправы, цесаревна Елизавета Петровна в своём уединении в Царском Селе уповала лишь на помощь Заступницы перед иконой Знамения Божией Матери. Образ этот - величайшая национальная духовная святыня - был дарован царю Алексею Михайловичу константинопольским патриархом св. Афанасием еще в 1653 году и с тех пор считался родовой иконой дома Романовых. Этим святым образом благословил Елизавету её великий отец, находясь уже на смертном одре. В 1734 году она поручила архитектору Ивану Бланку соорудить во имя этой иконы небольшую каменную церковь вблизи своего дворца в Царском. Она заложена в мае 1734 года и строилась по проекту И. Я. Бланка при участии архитектора М. Г. Земцова . Во время освящения храма в 1747 году икона Знамения заняла своё место над царскими вратами иконостаса и находилась в церкви почти два столетия. В дни войны и оккупации города Пушкина фашисты вывезли икону вместе с музейными ценностями Екатерининского дворца. Но чудотворный образ вернулся в Россию, и с 1946 года находится в церкви святого Апостола Евангелиста Иоанна Богослова Санкт-Петербургской Духовной Академии. Чтобы чтимая царскосельская святыня вернулась в стены Знаменской церкви, храм должен быть полностью восстановлен.

Здание церкви имеет типичные для барочных построек фасады, западный из которых украшен легким четырехколонным портиком, несущим балкон. Невысокий граненый купол и ажурная колокольня со шпилем придают церкви некоторую декоративность. Внутри храм делится на три нефа – средний и два боковых. Впоследствии, в течении XIX века, церковь неоднократно достраивалась и перестраивалась.

Знаменскую церковь посещали члены императорской фамилии, прихожанами храма были историк Николай Карамзин, воспитанники Царскосельского лицея и в их числе Александр Пушкин, здесь бывала и молилась Анна Ахматова.

Перед началом Великой Отечественной войны Знаменская церковь оставалась единственной действующей в г. Пушкине. Официально она не закрывалась, и даже во время оккупации в ней происходили Богослужения. Перед отступлением немецкими захватчиками из храма были похищены большинство икон и церковной утвари, однако само здание в целом не пострадало, внутри даже сохранился иконостас (без икон). Однако в августе 1942 года церковь перестала быть действующей. Опустевшая, разграбленная Знаменская церковь использовалась не по назначению. В 1960 - 1962 годах она была отреставрирована. При восстановлении на основе архивных материалов, планов и сохранившихся чертежей архитектора П. Неелова воссоздан первоначальный архитектурный облик храма. Удалены все позднейшие пристройки, шпилю колокольни и куполу приданы прежние очертания. Вплоть до 1990-х годов в церкви размещалась контора мастерской объединения "Реставратор", находившегося в ведении Екатерининского дворца-музея.

В 1991 году здание храма было возвращено верующим и 10 декабря 1991 года, в день иконы Божией Матери "Знамение", церковь была открыта для Богослужений. Церковь была приписана к Софийскому Вознесенскому собору. Инженерное обследование 1992 года показало, что здание находится в аварийном состоянии. В стенах были страшные трещины, доходившие до 20 см. Церковь стояла буквально на земле, и надо было укреплять фундамент, спасая здание от губительной сырости. Пострадала внутренняя отделка, был поврежден купол, утрачены печи, паркетные полы, иконостас...

Сегодня, спустя десять лет, восстановление старинной царскосельской церкви практически завершено. Внутренняя Церковь реставрировалась на государственные средства. Здание находится на балансе КГИОП, который следил за точным восстановлением всех деталей убранства и декора. Отремонтированы кровля, снова позолочен шпиль и флюгер на шпиле. К юбилею Петербурга был воссоздан фарфоровый иконостас. Сейчас здесь можно видеть новые иконы. Их по одной создавали в художественной мастерской, затем все они заняли место в новом иконостасе. С недавних пор здесь очень почитается икона царственных мучеников. В 2003 году обновленный храм вновь засиял, как во времена Пушкина и Карамзина, и стал таким же олицетворением Царского Села, как восставшая из руин София; и сегодня колокольный звон Знаменской церкви ежечасно возвещает о возрожденной царскосельской святыне.